Исследовательская работа «Анализ поврежденности ДНК методом ДНК-комет»

Технологии мониторинга и прогнозирования состояния окружающей среды, предотвращения и ликвидации ее загрязнения являются приоритетным направлением развития науки, технологий и техники. Биомониторинг является составной частью экологического мониторинга. Важнейшим показателем экологического благополучия признается сохранение здоровья и комфортное проживание человека. Чувствительной молекулярной мишенью действия средовых и производственных факторов в организме человека является ДНК. Метод ДНК-комет является методом выбора для выявления повреждений ДНК в органах и тканях человека. Определение уровня поврежденности ДНК служит индикатором локального экологического прессинга и является прогностически значимым показателем генетического здоровья населения. Очевидно, что данные биомониторинга, полученные методом ДНК-комет, позволят судить о естественном уровне целостности наследственного материала — генома с учетом особенностей климата, факторов окружающей среды, возрастного и полового состава.

Гипотеза: нахождение в задымлении приводит к изменениям.

Цель исследования: определить степень влияния токсиканта на генетический аппарат (определить уровень повреждённости ДНК).

Объект исследования: головной мозг мелких лабораторных животных (крысы).

Предмет исследования: метод ДНК-комет.

Задачи:

1. теоретическое ознакомление со структурой нервной ткани;
2. теоретическое ознакомление со строением генетического аппарата;
3. теоретическое ознакомление с методом ДНК-комет;
4. самостоятельный анализ фотографий, статистический анализ результатов.

Методические аспекты проведения ДНК-комет-тест в условиях in vivo в доклинических исследованиях:

1. Выбор животных.
2. Вещества для положительного контроля.
3. Особенности криоконсервации органов лабораторных животных.
4. Приготовление препаратов клеток.
5. Лизис клеток.
6. Щелочная денатурация (разрушение).
7. Электрофорез.
8. Окраска микропрепаратов.
9. Визуализация и анализ ДНК-комет.

Материалы и методы в данном эксперименте. Материал (мозг) забирали после декапитации экспериментальных животных под эфирным наркозом. Регистрацию окрашенных (красителем SYBRGreen I) препаратов производили на микроскопе OLYMPUS ВХ-52, совмещенном с цифровой камерой OLYMPUS RХ-420, при увеличении ×100. Изображения ДНК-комет анализировали с помощью программы CASP 1.2.2. В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание фрагментов ДНК в хвосте комет. Для каждого слайда анализировали 15-20 ядер. Статистический анализ результатов исследования проводили с использованием пакета прикладных программ Statistiсa 6.1 (StatSoft). Для сравнения групп применяли U-критерий Манна Уитни. Нулевые гипотезы об отсутствии различий между группами отвергали при достигнутом уровне значимости соответствующего статистического критерия р ≤ 0,05 Результаты представляли в виде медианы и интерквантильного размаха – Me (Q25–Q75).